生研界 - 腺相关病毒包装

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腺相关病毒包装

一、实验原理

目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。

目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。

相对于Adeasy系统，AdMAX系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1, 3Cre双载体组成。

二、应用简介

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

实验平台的腺相关病毒血清型种类齐全，可提供AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-DJ共10种血清型，而且还可以包装双链AAV（scAAV）。

腺相关病毒载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、RK1、EF1a、GFAP等多种启动子可供选择；而且还有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多种荧光标记蛋白可供选择；同时可以提供诱导型AAV病毒的包装，如Tet-On系统等。

可用于：常规基因过表达和干扰AAV定制；组织特异性启动子过表达AAV定制；组织特异性DIO AAV的定制（需结合组织特异性Cre工具鼠使用）；常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制；AAV-mRFP-GFP-LC3自噬流监测工具；各种AAV介导的光遗传和化学遗传载体现货及改造服务等。

三、实验方法

四、样本送检要求

五、案例展示

腺相关病毒各血清型载体体外感染细胞系

六、常见问题

1、高纯度的低熔点琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用沸水浴完全融化，然后自然降温到45℃待用。用37℃预热的完全培养基稀释5%的琼脂糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到去除培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。6孔板每孔覆盖3 ml琼脂糖/培养基。

2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。

3、收集细胞的时候一般使用细胞刮，不能用胰酶消化，4℃ 500´g离心10 min，去除大部分上清，只留取2 ml上清重悬细胞沉淀进行-80℃（干冰或者液氮均可）冻融。

4、37℃冻融时一旦病毒融化就马上取出，长时间在37℃温育会降低病毒滴度，完全融化后可以剧烈震荡30s。冻融周期通常会持续2~4次才可以获得高滴度的病毒。

细胞冻融结束裂解液可以4℃ 500×g离心10 min，不立即使用的话可以冻存在-20℃或-80℃。

七、服务流程